秦巴山区香菇液体种生产工艺及开发利用研究
发布时间：2015/11/9 14:46:42
成果简介：
依托陕西省食药用菌工程技术研究中心，以秦巴山区主栽香菇品种为试验材料，开展以下工作：
（1）香菇液体种的生产工艺及富硒研究 采用响应面设计法与食用菌液体深层发酵技术等得到的香菇液体种的生产工艺。该研究技术所得香菇菌丝生物转化量较高，菌丝球小、密度大且大小均匀，同时生产工艺简单且成本低，可为香菇菌株液体种的生产和栽培提供技术支持。
（2）香菇胞外多糖提取工艺研究 通过单因素和Box-Behnken响应面试验得到香菇菌株发酵液中胞外多糖的提取工艺条件。本研究工艺简单、费时少且成本低。
创新点：
（1）“响应面法在香菇液体种生产工艺优化中的应用”属国内次报道。
（2）利用Box-Behnken响应面法得到香菇菌株发酵液中胞外多糖提取的工艺参数准确可靠，具有推广应用价值，可为工业化生产香菇胞外多糖提供技术支持。
成果内容提要：
一、主要观点
秦巴山区气候温润，非常适宜菌类生长，该地区用于栽培生产的香菇菌株多样。香菇作为食用菌生产的支柱产业之一，其液体种的生产工艺是提高香菇生产效率的关键。利用廉价农副产品做原料，采用液体深层发酵技术可规模化培养香菇菌丝体，制作香菇液体种。研究表明，由于其发酵液中的多糖含量高于香菇子实体，因此发酵液可用于香菇多糖的工业化生产。另外，硒是人体所必需的微量元素，香菇具有的富硒能力，可通过制作富硒香菇液体种来生产富硒香菇。
本研究依托陕西省食药用菌工程技术研究中心，以秦巴山区主栽香菇品种为材料，开展了以下工作：
（1）以香菇菌丝体生物转化量为主要指标，先用单因素试验筛选出适合香菇南山1号菌丝生长的碳、氮源，在此基础上利用Minitab 15软件做Plackett-Burman设计试验，筛选出对菌丝生物转化量影响显著的因子：玉米粉、麦麸、MgSO4•7H2O和接种量；然后进行陡爬坡试验，选出响应区域，采用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken模式做4因素3水平响应面分析试验，得到优的液体种生产工艺条件：玉米粉36.0 g、麦麸21.0 g、红糖20.0 g、牛肉粉4.0 g、KH2PO4 3.0 g、MgSO4•7H2O 0.6 g、VB1 10.0 mg、H2O 1.0 L，初始pH 6.2、接种量7.0%、温度29 ℃、180 r/min摇床发酵10 d，此条件下菌丝生物转化量可达51.004 g/L。实测值与拟合值相比，相对误差约为2.098%。说明响应面法用于香菇液体菌种生产优化是可行的，数学模型的预测值与实验观察值相符；
（2）以香菇“南山1号”菌种为试材，采用L9(34)正交试验筛选得到富硒香菇的优化液体培养基配方。结果表明：香菇菌种在固体和液体培养基中Na2SeO3的适浓度为60 mg/L，富硒香菇的适液体培养基配方为：玉米粉 30.0 g/L、黄豆粉 6.0 g/L、KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4•7H2O 0.5 g/L、H2O 1000 mL、pH自然。
（3）以秦巴山区10株香菇主栽菌株为试材，采用组织培养方法对其菌丝生长速度、菌丝形态特征进行分析，采用CTAB法对其DNA提取、PCR扩增及扩增产物进行测序比对，依据ITS序列分析和构建系统进化树。结果表明：“香菇808”和“香菇507”两菌株具有较高生长优势且亲缘关系较远，可作为原生质体制备、融合及再生的菌株。
（4）采用组织培养方法，用6种筛选培养基对秦巴山区主栽香菇菌株的菌丝生长状况和胞外多糖高产菌株进行了研究。结果表明，香菇66#菌株的菌丝在筛选培养基B中的生长速度为3.26 mm/d，菌丝粗壮且致密；以此培养基（葡萄糖 1.0%、玉米粉 2.0%、麦麸 2.0%、酵母膏 0.3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4•7H2O 0.1%、pH自然）进行液体发酵，其菌丝球数量多，大小均匀，生物转换量为66.00 g/L，胞外多糖产量可达2.99 g/L发酵清液。
（5）为了优化香菇发酵液中胞外多糖的提取工艺，采用Box-Behnken响应面设计法，研究醇沉时间、乙醇浓度、pH及其交互作用对香菇胞外多糖产量的影响。利用Design-Expert 8.0.6软件和响应面分析相结合的方法，模拟得到回归方程的预测模型和可信度，分析得到香菇发酵液中胞外多糖的提取工艺条件为：醇沉时间17.71 h，乙醇浓度78.66%，pH 7.93。在此条件下，香菇胞外多糖产量达到3.1528 g/L。
二、创新点
（1）“响应面法在香菇液体种生产工艺优化中的应用”属国内次报道。
（2）利用Box-Behnken响应面法得到香菇菌株发酵液中胞外多糖提取的工艺参数准确可靠，具有推广应用的价值，可为工业化生产提供技术支持。
三、实践意义
（1）通过响应面设计法对香菇液体种的生产工艺进行优化，为香菇液体种的工业化制备和生产提供了理论参考，研究得到的生产工艺简单、成本低。同时，香菇生产效率高、品质好、污染率小，具有推广应用价值，为秦巴山区的香菇栽培提供了技术支持；
（2）通过正交试验等方法筛选出富硒香菇菌丝生长的适液体培养基，为秦巴山区富硒香菇液体菌种的生产提供了理论依据；
（3）通过核糖体转录间隔区(ITS)序列分析秦巴山区主栽香菇菌株的亲缘关系，为秦巴山区香菇种质资源库的建立和新品种培育提供了理论依据；
（4）通过组织培养法筛选秦巴山区香菇胞外多糖高产菌株，为秦巴山区香菇优势菌种的开发利用及胞外多糖的生产提供了参考依据；
（5）通过乙醇一步沉淀法和响应面设计法优化得到的香菇胞外多糖提取工艺简单、费时少且成本低，具有推广应用的价值，为从发酵液中提取香菇多糖的工业化生产提供了参考依据。
社会反映：
（1）本研究所得香菇液体种的菌丝生物转化量较高，菌丝球小、密度大且大小均匀，生产工艺简单且成本低。通过在陕西汉中天佑农业科技有限责任公司和陕西天美绿色产业有限公司的推广栽培表明，袋料有菌丝萌发快，发菌点多。同时，香菇的生产效率提高，品质好，接种污染得到有效的控制。
（2）本研究所得香菇发酵液中胞外多糖产量较高，同时提取工艺简单、费时少且成本低，为香菇多糖的工业化生产提供了技术支持。
依托陕西省食药用菌工程技术研究中心，以秦巴山区主栽香菇品种为试验材料，开展以下工作：
（1）香菇液体种的生产工艺及富硒研究 采用响应面设计法与食用菌液体深层发酵技术等得到的香菇液体种的生产工艺。该研究技术所得香菇菌丝生物转化量较高，菌丝球小、密度大且大小均匀，同时生产工艺简单且成本低，可为香菇菌株液体种的生产和栽培提供技术支持。
（2）香菇胞外多糖提取工艺研究 通过单因素和Box-Behnken响应面试验得到香菇菌株发酵液中胞外多糖的提取工艺条件。本研究工艺简单、费时少且成本低。
创新点：
（1）“响应面法在香菇液体种生产工艺优化中的应用”属国内次报道。
（2）利用Box-Behnken响应面法得到香菇菌株发酵液中胞外多糖提取的工艺参数准确可靠，具有推广应用价值，可为工业化生产香菇胞外多糖提供技术支持。
成果内容提要：
一、主要观点
秦巴山区气候温润，非常适宜菌类生长，该地区用于栽培生产的香菇菌株多样。香菇作为食用菌生产的支柱产业之一，其液体种的生产工艺是提高香菇生产效率的关键。利用廉价农副产品做原料，采用液体深层发酵技术可规模化培养香菇菌丝体，制作香菇液体种。研究表明，由于其发酵液中的多糖含量高于香菇子实体，因此发酵液可用于香菇多糖的工业化生产。另外，硒是人体所必需的微量元素，香菇具有的富硒能力，可通过制作富硒香菇液体种来生产富硒香菇。
本研究依托陕西省食药用菌工程技术研究中心，以秦巴山区主栽香菇品种为材料，开展了以下工作：
（1）以香菇菌丝体生物转化量为主要指标，先用单因素试验筛选出适合香菇南山1号菌丝生长的碳、氮源，在此基础上利用Minitab 15软件做Plackett-Burman设计试验，筛选出对菌丝生物转化量影响显著的因子：玉米粉、麦麸、MgSO4•7H2O和接种量；然后进行陡爬坡试验，选出响应区域，采用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken模式做4因素3水平响应面分析试验，得到优的液体种生产工艺条件：玉米粉36.0 g、麦麸21.0 g、红糖20.0 g、牛肉粉4.0 g、KH2PO4 3.0 g、MgSO4•7H2O 0.6 g、VB1 10.0 mg、H2O 1.0 L，初始pH 6.2、接种量7.0%、温度29 ℃、180 r/min摇床发酵10 d，此条件下菌丝生物转化量可达51.004 g/L。实测值与拟合值相比，相对误差约为2.098%。说明响应面法用于香菇液体菌种生产优化是可行的，数学模型的预测值与实验观察值相符；
（2）以香菇“南山1号”菌种为试材，采用L9(34)正交试验筛选得到富硒香菇的优化液体培养基配方。结果表明：香菇菌种在固体和液体培养基中Na2SeO3的适浓度为60 mg/L，富硒香菇的适液体培养基配方为：玉米粉 30.0 g/L、黄豆粉 6.0 g/L、KH2PO4 1.5 g/L，MgSO4•7H2O 0.5 g/L、H2O 1000 mL、pH自然。
（3）以秦巴山区10株香菇主栽菌株为试材，采用组织培养方法对其菌丝生长速度、菌丝形态特征进行分析，采用CTAB法对其DNA提取、PCR扩增及扩增产物进行测序比对，依据ITS序列分析和构建系统进化树。结果表明：“香菇808”和“香菇507”两菌株具有较高生长优势且亲缘关系较远，可作为原生质体制备、融合及再生的菌株。
（4）采用组织培养方法，用6种筛选培养基对秦巴山区主栽香菇菌株的菌丝生长状况和胞外多糖高产菌株进行了研究。结果表明，香菇66#菌株的菌丝在筛选培养基B中的生长速度为3.26 mm/d，菌丝粗壮且致密；以此培养基（葡萄糖 1.0%、玉米粉 2.0%、麦麸 2.0%、酵母膏 0.3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4•7H2O 0.1%、pH自然）进行液体发酵，其菌丝球数量多，大小均匀，生物转换量为66.00 g/L，胞外多糖产量可达2.99 g/L发酵清液。
（5）为了优化香菇发酵液中胞外多糖的提取工艺，采用Box-Behnken响应面设计法，研究醇沉时间、乙醇浓度、pH及其交互作用对香菇胞外多糖产量的影响。利用Design-Expert 8.0.6软件和响应面分析相结合的方法，模拟得到回归方程的预测模型和可信度，分析得到香菇发酵液中胞外多糖的提取工艺条件为：醇沉时间17.71 h，乙醇浓度78.66%，pH 7.93。在此条件下，香菇胞外多糖产量达到3.1528 g/L。
二、创新点
（1）“响应面法在香菇液体种生产工艺优化中的应用”属国内次报道。
（2）利用Box-Behnken响应面法得到香菇菌株发酵液中胞外多糖提取的工艺参数准确可靠，具有推广应用的价值，可为工业化生产提供技术支持。
三、实践意义
（1）通过响应面设计法对香菇液体种的生产工艺进行优化，为香菇液体种的工业化制备和生产提供了理论参考，研究得到的生产工艺简单、成本低。同时，香菇生产效率高、品质好、污染率小，具有推广应用价值，为秦巴山区的香菇栽培提供了技术支持；
（2）通过正交试验等方法筛选出富硒香菇菌丝生长的适液体培养基，为秦巴山区富硒香菇液体菌种的生产提供了理论依据；
（3）通过核糖体转录间隔区(ITS)序列分析秦巴山区主栽香菇菌株的亲缘关系，为秦巴山区香菇种质资源库的建立和新品种培育提供了理论依据；
（4）通过组织培养法筛选秦巴山区香菇胞外多糖高产菌株，为秦巴山区香菇优势菌种的开发利用及胞外多糖的生产提供了参考依据；
（5）通过乙醇一步沉淀法和响应面设计法优化得到的香菇胞外多糖提取工艺简单、费时少且成本低，具有推广应用的价值，为从发酵液中提取香菇多糖的工业化生产提供了参考依据。
社会反映：
（1）本研究所得香菇液体种的菌丝生物转化量较高，菌丝球小、密度大且大小均匀，生产工艺简单且成本低。通过在陕西汉中天佑农业科技有限责任公司和陕西天美绿色产业有限公司的推广栽培表明，袋料有菌丝萌发快，发菌点多。同时，香菇的生产效率提高，品质好，接种污染得到有效的控制。
（2）本研究所得香菇发酵液中胞外多糖产量较高，同时提取工艺简单、费时少且成本低，为香菇多糖的工业化生产提供了技术支持。
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